Galilei era un hábil ejecutante del laúd que atrajo la atención de poderosos mecenas desde muy joven. En 1563 conoció en Venecia a Gioseffo Zarlino, el teórico musical más importante del siglo XVI, y comenzó a estudiar con él. Algo más tarde se interesó en los intentos de revivir la música y el teatro griegos antiguos , a través de su asociación con la Camerata florentina, un grupo de poetas, músicos e intelectuales encabezados por el conde Giovanni de' Bardi, así como sus contactos con Girolamo Mei, el principal erudito de la época de la música griega antigua. Galilei compuso dos libros de madrigales, así como música para laúd y una cantidad considerable de música para voz y laúd; esta última categoría se considera su contribución más importante, ya que anticipó en muchos aspectos el estilo del barroco temprano.

Edición discográfica de obras de Vincenzo Galilei

Vincenzo fue una figura en la vida musical del Renacimiento tardío y contribuyó significativamente a la revolución musical que marca el comienzo de la era barroca. En su estudio del tono y la tensión de las cuerdas, Galilei produjo quizás la primera descripción matemática no lineal de un fenómeno natural conocido en la historia. Le dan crédito por dirigir la actividad de su hijo lejos de las matemáticas puras y abstractas y hacia la experimentación utilizando la descripción matemática cuantitativa de los resultados, una dirección de importancia para la historia de la física y las ciencias naturales. El uso del recitativo en la ópera se atribuye ampliamente a Galilei, ya que fue uno de los inventores de la monodia , el estilo musical más cercano al recitativo.

Galilei se anticipó a “El clave bien temperado” de Bach al promover el buen temperamento (temperamento no igual). En su exploración de la afinación y las tonalidades, compuso 24 grupos de danzas, "claramente relacionados con 12 tonalidades mayores y 12 tonalidades menores" (1584). Algunas de las contribuciones teóricas más importantes de Galilei involucran el tratamiento de la disonancia: tenía una concepción en gran medida moderna, permitiendo la disonancia pasajera "si las voces fluyen suavemente", así como la disonancia en el tiempo, como las suspensiones, a las que llamó "disonancia esencial". "Esto describe la práctica barroca, especialmente cuando define las reglas para la resolución de suspensiones mediante un salto preliminar que se aleja de la nota de resolución esperada y luego vuelve a ella.

Vincenzo Galilei fue uno de los pioneros en el estudio sistemático de la acústica, principalmente en sus investigaciones (asistidas por su hijo Galileo) en la fórmula matemática de las cuerdas estiradas. Galileo le dijo a su biógrafo que Vincenzo le presentó la idea de las pruebas y mediciones sistemáticas a través del sótano de su casa de Pisa, que estaba ensartado con cuerdas de laúd, cada una de diferentes longitudes, con diferentes pesos adjuntos. Fue también uno de los precursores del estilo Barroco en la mayoría de sus composiciones.